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病理學前沿

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<img src="http://proec57c364.pic8.websiteonline.cn/upload/222.jpeg" width="2560" height="1920"/>一、區(qū)域劃分 按功能可分為：實驗區(qū)、準備區(qū)和辦公區(qū)。 01 實驗區(qū) 樣本接收區(qū)： 接收臨床送檢的體液及石蠟樣本，核對患者信息，對所接收的樣本進行登記編號，體液樣本置于4℃保存，及時處理。 樣本前處理區(qū)： 用于組織切片、脫蠟、染色及血液、尿液、胸腹水等標本的離心、涂片、染色等。體系突變檢測時，需對組織學或細胞學樣本進行病理質控，目的是進一步明確病變組織或細胞與病理診斷是否一致；評估腫瘤細胞的比例是否達到檢測要求；確定腫瘤細胞位置，富集腫瘤細胞，避免出血、壞死、間質細胞影響DNA質量。因該區(qū)域使用二甲苯等有毒有害物質，需設置通風櫥，做好化學安全防護，且配有廢液桶，廢棄的二甲苯等化學污染物統(tǒng)一回收處理。 試劑暫存及準備區(qū)： 試劑暫存區(qū)需配備4℃和-20℃以下冰箱，按照試劑儲存條件分別儲存，并記錄使用情況。準備區(qū)根據反應體系，配制各反應試劑。 樣本制備區(qū)： 石蠟樣本癌組織的富集、樣本的消化、DNA和ＲNA的提取及OD值的測定。該區(qū)域安置外排式二級生物安全柜，降低實驗過程中產生的有害氣溶膠對實驗人員和環(huán)境的危害。特別是用于檢測胚系突變的血液樣本和攜帶各種病毒的樣本，均需在生物安全柜內完成操作，做好生物安全防護。如有計劃開展通過超敏感的方法對血液中微量的循環(huán)DNA進行檢測的項目，本區(qū)域需獨立劃分用于提取微量循環(huán)DNA區(qū)域，防止其他樣本高濃度的DNA對微量循環(huán)DNA的污染。 核酸片段化區(qū)： 樣本核酸的打斷。該區(qū)域可能產生核酸氣溶膠，屬于核酸污染區(qū)，需要做好相應防護的清潔處理。 PCR擴增一區(qū)： 第1次PCR擴增。在PCR過程中可產生大量短片段的核酸，是核酸氣溶膠的重要來源。該區(qū)域屬于核酸污染區(qū)，需要盡量避免PCR反應時的爆管和PCR反應后開蓋，一旦發(fā)生要做好記錄并及時做好核酸污染的清潔處理，并監(jiān)測空氣中是否已經存在氣溶膠。 產物分析區(qū)： 對PCR產物或打斷后的核酸進行電泳檢測。核酸片段化分為機械打斷和酶消化打斷，機械打斷后需要對產物進行電泳檢測，評估核酸片段化狀態(tài)。該區(qū)域存在核酸片段化后或PCR擴增后產物開蓋的操作，也是核酸氣溶膠重要來源的區(qū)域，屬于核酸污染區(qū)。 純化一區(qū)： 第1次PCR產物純化、第1次雜交、第1次捕獲、第2次雜交、第2次捕獲及捕獲樣本純化。該區(qū)域存在PCR擴增后產物開蓋的操作，是核酸氣溶膠重要來源的區(qū)域，屬于核酸污染區(qū)。 PCR擴增二區(qū)： 第2次PCR擴增。注意事項同PCR擴增一區(qū)。 純化二區(qū)： 第2次PCR產物純化及文庫檢測。注意事項同純化一區(qū)。 測序區(qū)： 放置測序儀，進行上機測序。該區(qū)域自身不產生核酸氣溶膠，但需要采取防止被氣溶膠污染的措施，屬于核酸半污染區(qū)。 數據分析區(qū)： 數據處理分析，結果解讀及報告打印。該區(qū)域自身不產生核酸氣溶膠，屬于核酸半污染區(qū)。此外，若建立熒光原位雜交技術檢測平臺，需獨立設置以下兩個區(qū)域： 熒光原位雜交區(qū)：此區(qū)域主要進行低滲、預固定、固定、滴片、老化、消化、洗片、變性、雜交、再洗片等工作，該區(qū)域處理可能攜帶生物危害物的血液、骨髓、尿液或其他體液，需配備生物安全柜或通風櫥，預防生物污染物對工作人員的傷害。 熒光原位雜交觀察區(qū)：避光、安置熒光顯微鏡，觀察結果。 2 實驗準備區(qū) 高溫滅菌室： 配備高壓蒸汽滅菌器和高溫烘箱，設備功率較高，需單獨線路配電。因高壓蒸汽設備，該區(qū)域空氣交換12次/h。 危險品倉庫： 該區(qū)域應遠離實驗室和辦公區(qū)，安全出口通暢。所有危險化學品必須存放到鐵柜中，對于有腐蝕性、易燃易爆性的試劑，采取防腐防爆和通風措施，且鐵柜上加裝掛鎖，鑰匙專人保管。危險品倉庫應配有滅火器和滅火沙桶，做好防火工作。 一般倉庫： 存放移液器吸頭、離心管等，緊貼墻壁安裝貨架，將各類耗材按序排放，便于取用。 試劑儲存間： 試劑儲存分為室溫儲存（18℃-26℃）、冷藏儲存（2℃-8℃）和冷凍儲存（-20℃以下），試劑儲存間的冰箱和冷凍柜產生大量的熱，需安裝通風系統(tǒng)，注意環(huán)境溫度的控制。冰箱和冷凍柜應裝配帶警示的溫度監(jiān)測系統(tǒng)，當溫度異常時發(fā)出警報，工作人員可及時處理，避免試劑失效。 3 辦公區(qū)該區(qū) 主要用于實驗人員工作、學習、休息場所，為潔凈區(qū)，需要遠離生物污染區(qū)和危險品倉庫。對于步驟多、流程長的檢測平臺，為防止污染，實驗室功能區(qū)設計盡量細分。如果實驗室有多個檢測技術平臺，根據使用儀器的功能，可適當合并功能區(qū)。筆者認為，實驗室的污染分為生物污染和核酸污染，生物污染主要是在處理體液樣本的區(qū)域，而核酸污染主要在核酸提取、擴增和分析的區(qū)域。據此，應將實驗室劃分為以生物污染對象的生物污染區(qū)、生物半污染區(qū)和生物潔凈區(qū)，也可以將實驗室劃分為以核酸污染對象的核酸污染區(qū)、核酸半污染區(qū)和核酸潔凈區(qū)。 二、氣流流向 PCR實驗室中容易產生核酸短片段形成的氣溶膠污染，氣溶膠是懸浮于氣體介質中的由粒徑為0.001μm～100μm的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對穩(wěn)定的分散體系。一旦發(fā)生核酸氣溶膠污染，會直接導致核酸檢測結果出現(xiàn)錯誤，并且比較難以去除這種污染。為防止核酸氣溶膠污染，各功能區(qū)需安裝獨立的通風系統(tǒng)，密封，不得交叉通風，避免交叉污染。 對于實驗室通風，氣流宜采用上送下排方式，送風口和排風口布置應有利于室內可能被污染空氣的排出，在生物安全柜操作面或其他有氣溶膠產生的地點上方附近不應設置送風口。各區(qū)域空氣交換12次/h～16次/h。實驗室亦可采取窗戶進行自然通風，但需設防蟲紗窗和防節(jié)肢動物設施。有條件的實驗室可安裝負壓裝置，功能區(qū)內氣壓（負壓）與室外大氣壓的壓差值應＞30Pa，與相鄰區(qū)域的壓差（負壓）應＞10Pa。 三、緩沖區(qū)間 實驗功能區(qū)均需設置緩沖區(qū)間，控制空氣的流向，緩沖區(qū)間門具有互鎖功能，不能同時處于開啟狀態(tài)。緩沖區(qū)間內設置非手動開關的洗手裝置、衣架或衣柜，方便實驗人員進出換實驗服。不同功能區(qū)緩沖區(qū)間應使用不同顏色的工作服，工作人員離開各緩沖區(qū)間不得將工作服帶出。 四、應急設置 應在樣本前處理區(qū)和樣本制備區(qū)內安置緊急沖淋洗眼器及緊急淋浴裝置，便于緊急事故的處理。實驗室內應設置火災自動報警裝置和應急照明裝置，安全通道有消防疏散指示標志，并配備適用的應急器材，如消防器材、意外事故處理器材、急救器材等。 五、溫濕度控制 測序區(qū)、PCR擴增一區(qū)和二區(qū)等放置大型精密儀器的區(qū)域應恒溫恒濕，相對濕度宜控制在30%～70%范圍內。溫度宜控制在18℃～26℃范圍內，2h內溫度波動應＜2℃，避免環(huán)境因素影響實驗結果。 六、二級生物安全實驗室 二級生物安全實驗室的用電負荷不宜低于二級，大型重要精密設備需單獨線路配電，并配備不間斷電源（UPS），保證電源電壓的穩(wěn)定。另外，各功能區(qū)需安裝可定時的紫外燈，紫外燈發(fā)出波長為254nm的紫外線，可使長片段的核酸斷裂，即防止生物污染，又防止核酸污染。安裝在拋光天花板上的固定紫外燈距地面距離＜2.1m，紫外燈的數量由各區(qū)域空間決定，確保照射劑量＞9000uW·s/cm。

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